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巢式PCR(NEST PCR枝術(shù).

先用一對靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量.然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶。此為巢式PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR。為減少 巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些，且用量較少。同時在第yi次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度。這樣在第yi次PCR時，由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合,故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過若干次循環(huán)。待外引物基本消耗盡，無需取出第yi次PCR產(chǎn)物，只需降低退火即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟。同時也降低了交叉污染的機(jī)會。這種PCR稱中途進(jìn)退式PCR( drop-in, drop-out PCR)上述三種方法主要用于少量DNA模板的擴(kuò)增。

等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR. ASPCR技術(shù)

ASPCR依賴于引物3”-端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點突變的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后檢測不到擴(kuò)增產(chǎn)物.可用于檢測基因點突變。

單鏈構(gòu)型多態(tài)性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技術(shù)

SSCP- PCR是根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙1烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的中性聚丙1烯酰胺凝膠中,單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關(guān)外,更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象。相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異所形成的構(gòu)象就會不同，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時，每條單鏈處于一定的位置.靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時.就會出現(xiàn)泳動變位。從而提示該片段有基因變異存在。

突變：PCR克1隆的一大優(yōu)點是能夠通過克1隆將所需突變引入目的基因中，以便進(jìn)行突變研究。在 定1點突變中，經(jīng)過設(shè)計的PCR引物可將堿基置換、刪除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克1隆至質(zhì)粒中的序列上。隨后，含有引入突變的PCR產(chǎn)物通過自我連接，重新生成環(huán)狀質(zhì)粒，并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

測序：PCR是為測序富集模板DNA的一種相對簡單的方法。為保證DNA序列準(zhǔn)確性，強(qiáng)烈建議使用高保真PCR來制備測序模板。在 Sanger測序中，PCR擴(kuò)增片段經(jīng)純化并用于測序反應(yīng)。使用常用的測序引物結(jié)合位點對PCR引物的 5′末端進(jìn)行標(biāo)記，以簡化測序工作流程。

         二代測序 （NGS）中，PCR被廣泛用于構(gòu)建DNA測序文庫。在NGS文庫制備中，DNA樣品通過PCR反應(yīng)富集（在起始量有限的情況下）并使用adaptor（以及用于多重檢測的index）標(biāo)記。除了具有高保真度，DNA聚合酶還應(yīng)具有zui小的擴(kuò)增偏好性，從而使測序文庫具有高覆蓋度。

目前的病毒核酸檢測試劑盒，多數(shù)采用熒光定量PCR方法，通過檢測熒光信號的累積來確定樣本中是否含有病毒核酸。那么，核酸檢測到底需要經(jīng)過哪些步驟呢？概括起來，是 取樣、留樣、保存、核酸提取和上機(jī)檢測五個步驟。

取樣

采集人體的分泌物。用鼻咽拭子或咽拭子擦拭鼻腔或咽后壁及雙側(cè)扁桃體處

留樣

將拭子頭浸入細(xì)胞保存液中，折斷尾部后立即旋緊管蓋

保存

將樣本管放入密封袋中保存好，并及時送檢

核酸提取

將樣本送進(jìn)實驗室進(jìn)行核酸提取

上機(jī)檢測

將提取物進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)